微生物的实验室培养
班级： 姓名： 编辑：吴定
【课程目标】
了解培养基的基础知识，进行微生物培养和无菌技术的操作。
【课题重点及难点】
无菌技术的操作
【知识梳理】
一、基础知识
1、培养基
① 概念：人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其 的营养基质叫培养基。可分为 培养基和 培养基。
② 营养构成：各种培养基一般都含有 、 、 和 ，此外还要满足微生物生长对 、 以及 的要求。
③ 培养乳酸杆菌时需在培养基中添加 、培养霉菌时需将培养基PH调至 、培养细菌时需将pH调至 、培养厌氧微生物则需提供 条件。
2、无菌技术
① 获得纯净培养物的关键是 。
② 无菌技术：（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行 ；
（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行 ；
（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在 旁进行；
（4）避免已灭菌处理的材料用具与 相接触。
③ 消毒方法：（1）日常生活经常用到的是 消毒法；
（2）对一些不耐高温的液体，则使用 消毒法；
（3）对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒石炭酸或煤酚皂等溶液以增强消毒效果，然后使用紫外线进行物理消毒。
（4）实验操作者的双手使用 进行消毒；
（5）饮水水源用氯气进行消毒。
④ 灭菌方法：（1）接种环、接种针、试管口等使用 灭菌法，对接种环灭菌时要用酒精灯火焰的 层灼烧。
（2）玻璃器皿、金属用具等使用 灭菌法，所用器械是 ；
（3）培养基、无菌水等使用 ，所用器械是 。
（4）表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。
【补充】请结合P85附录4填空
利用干热灭菌箱对玻璃器皿灭菌时物品不能摆得太挤，目的是 。
物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌后，要首先打开排气阀，煮沸并排除锅内冷空气，其目的是有利于锅内温度升高；随后关闭排气阀继续加热，气压升至 ，温度为 ，并维持15～30 min；最后切断热源，使温度自然降温，气压务必降至 时打开锅盖，其目的是防止容器中的液体暴沸 。
二、实验操作
1、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
（1）基本步骤： → → （→调pH）→ →倒平板[每个步骤都要清楚掌握！]
（2）倒平板的过程
①在火焰旁右手拿 ，左手 ；
②使锥形瓶的瓶口 ；
③左手将培养皿 ，右手 ，左手立刻盖上皿盖。
④待平板冷却凝固后，将平板 。
（3）注意事项：
①待培养基冷却到 时才能用来倒平板，温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。
②整个操作在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。
③平板需 ，这样既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止培养皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
2、纯化大肠杆菌
（1）原理：在培养基上将细菌 成单个细胞，使其长成单个菌落，这个菌落就是一个纯化的细菌菌落。
（2）方法：微生物接种的最常用方法是 和 ，另外还有穿刺接种和斜面接种等。
（3）平板划线操作及注意事项：
平板划线法是 的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
其操作步骤是：
①将 在酒精灯火焰上灼烧直至 。
②在酒精灯火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞。
③将菌种试管口通过火焰达到 的目的。
④将冷却的接种环伸入到 。
⑤将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。
⑥将皿盖打开一条缝隙，把接种环 ，盖上皿盖，不要划破培养基。
⑦灼烧接种环，冷却后从 划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线。注意不要将 相连。
⑧将平板 ， 培养。
注意事项：
①操作的第一步及每次划线之前都需要将接种环灼烧灭菌，划线操作结束时仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的如下表：
| 项目 | 操作的第一步灼烧 | 每次划线之前灼烧 | 划线结束时灼烧 |
| 目的 |
②灼烧接种环之后，要冷却后才能再进行划线，以免 。
③划线时最后一区域不要与第一区域相连。
④划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
（4）稀释涂布平板操作：
稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的 ，然后将 进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落。
系列稀释操作步骤：
①取盛有 mL水的无菌试管6支 ，编号101、102、103、104、105、106。
②用灼烧冷却的移液管吸取 mL菌液注入编号为101倍稀释的试管中，并吹打3次使之混匀。
③从101倍液中吸取 mL菌液注入到编号为102试管内吹打均匀，获得102倍液。依此类推。
3、菌种保存
(1)对于频繁使用的菌种，可以采用 的方法。
将菌种接种到试管的固体 上，在 的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入____的冰箱中保藏。以后每 个月，都要重新将菌种从旧的培养基上 到新鲜的培养基上。
缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易 或产生 。
(2)对于需要 保存的菌种，可以采用 管藏的方法。
过程：在3mL甘油瓶中装入1mL甘油→ →将1mL培养的菌液转移至甘油瓶中，与甘油充分混匀→ 冷冻箱中保存。
【拓展提升】
【拓展1】培养基的类型及其应用：
| 划分标准 | 培养基类型 | 配制特点 | 主要应用 |
| 物理性质 | 固体培养基 | 菌种分离,鉴定,计数 | |
| 液体培养基 | 工业生产，连续培养 | ||
| 化学成分 | 天然培养基 | 含化学成分不明确的天然成分 | 主要用于工业生产 |
| 合成培养基 | 培养基化学成分已知 | 主要用于微生物的分类、鉴定 | |
| 用途 | 选择培养基 | 培养基中添加某种化学物质，以抑制杂菌生长，促进所需微生物生长 | 培养分离出特定微生物 |
| 鉴别培养基 | 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品 | 鉴别微生物 |
特别提醒：（1）加入培养基中的凝固剂（如琼脂），一般不能被微生物利用，只起到凝固作用。（2）选择培养基一般只生长具有特定功能的微生物，鉴别培养基可以存在其他微生物，而且能鉴别特定的微生物。
【归纳总结】消毒和灭菌的区别（最根本区别是 ）
| 项目 | 作用强度 | 结果 | 常用方法 | 应用的范围 |
| 消毒 | 较为 的理化因素 | 煮沸消毒法 | 一般物品 | |
| 巴氏消毒法 | ||||
| 化学药剂 | ||||
| 灭菌 | 的理化因素 | 灼烧灭菌 | ||
| 干热灭菌 | ||||
| 高压蒸汽灭菌 | 培养基及容器 |
【拓展2】生物的营养物质及几种微生物的营养能量来源[见表格]
植物的营养物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类。人及动物的营养物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。
碳源：如CO2、糖类、脂肪酸等有机物，构成微生物的结构物质和分泌物，并提供能量。
氮源：如N2、氨盐、硝酸盐、牛肉膏、蛋白胨等，主要用来合成蛋白质、核酸及含氮代谢物等。含有C、H、O、N的化合物既可以作为碳源，又可以作为氮源，如氨基酸等。
生长因子：某些微生物正常生长代谢过程中必须从培养基中吸收的微量有机小分子，如某些氨基酸、碱基、维生素等。
【课堂巩固】
一、选择题(每小题只有一个正确选项)
1．下列关于培养基的叙述，错误的是( )
A．碳源、氮源、无机盐、水等是微生物生长不可缺少的营养要素
B．根据微生物对碳源需要的差别，使用不同碳源的培养基
C．可在培养基中加入磷酸氢二钾或磷酸二氢钾，用于维持pH的相对稳定
D．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
2．下列所述环境条件下的微生物，能正常生长繁殖的是( )
A．在缺乏碳源的培养基中的硝化细菌 B．在人体表皮擦伤部位的破伤风杆菌
C．在新配制的植物矿质营养液中的酵母菌 D．在灭菌后的动物细胞培养液中的禽流感病毒
3．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧几种不同的灭菌处理，这些方法可依次用于杀灭哪些部位的细菌( )
A．接种针、手、培养基 B．手、培养基、接种针
C．培养基、手、接种针 D．接种针、培养基、手
4．牛肉膏可以为微生物提供的主要营养是( )
A．氮源和维生素 B．氢元素和氧元素
C．碳源、磷酸盐和维生素 D．无机盐
5．有关稀释涂布平板法，叙述错误的是 ( )
A．首先将菌液进行一系列的梯度稀释
B．然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面
C．其核心是防止杂菌污染，保证培养液的纯度
D．结果都是可在培养基表面形成单个的菌落
6．用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是( )
A．未接种的选择培养基 B．未接种的牛肉膏蛋白胨(全营养)培养基
C．接种了的牛肉膏蛋白胨(全营养)培养基 D．接种了的选择培养基
二、非选择题
7．炭疽病是由炭疽杆菌引起的一种人畜共患传染病，炭疽杆菌两端截平、呈竹节状排列，菌落呈卷发状，对炭疽病疑似患者，可根据噬菌体的宿主专一性，通过实验确诊。
(1)细菌培养：采集疑似患者的样本，分离培养，获得可疑菌落。
(2)细菌鉴定：实验流程如图所示。
①对配制的液体培养基等需采取 方法灭菌；实验所用液体培养基的碳源为 (填“无机碳”或“有机碳”)。
②挑选可疑菌落制片后，用 观察，可看到呈竹节状排列的杆菌。
③接种可疑菌后，35℃培养24小时，液体培养基变浑浊，原因是 ，对照组试管中应加入 ，与实验组同时培养6小时后，若实验组液体培养基的浑浊度比对照组____(填“高”或“低”)，则可明确疑似患者被炭疽杆菌感染；反之则排除。
④对排除的疑似患者及易感人群，可接种炭疽杆菌疫苗，刺激机体产生相应抗体。与产生抗体相关的细胞除T细胞、B细胞外，还有 、 。
8．某学校打算开辟一块食用菌栽培基地，以丰富学生的劳动技术课内容。首先对食用菌实验室进行清扫和消毒处理，准备食用菌栽培所需的各种原料和用具，然后从菌种站购来各种食用菌菌种。请回答：
(1)对买回来的菌种进行扩大培养，首先制备试管培养基，写出制备固体牛肉膏蛋白胨培养基所需的原料 ： 、 、 、 、 。其中提供氮源的是 。
(2)微生物在生长过程中对各种成分所需量不同，配制培养基时各成分要有合适的 。在烧杯中加入琼脂后要不停 ，防止 。
(3)将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干个试管一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入 中灭菌，压力100 kPa，温度 ，时间15～30 min。灭菌完毕后拔掉电源，待锅内压力自然降到0时，将试管取出。如果棉塞上沾有培养基，此试管应 。
(4)使用高压蒸汽灭菌锅时注意，先向锅内倒入 ，把锅内水加热煮沸并将其中原有冷空气彻底排出后将锅密闭。
(5)从一支试管向另一支试管接种时注意，接种环要用酒精灯____(“内”或“外”)焰灭菌，并且待接种环后蘸取菌种，试管口不能离开酒精灯火焰附近，将接种的试管放入____℃冰箱中保藏。
9．自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。
步骤如下：
(1)制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。
(2)为了得到更加准确的结果，选用适宜的方法接种样品：上图是利用 法进行微生物接种，把聚集的菌种逐步 分散到培养基的表面，为达到这一目的，操作上应注意： 。
(3)适宜温度下培养。
结果分析：
①测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是( )
A．一个平板，统计的菌落数是230
B．两个平板，统计的菌落数是220和260，取平均值240
C．三个平板，统计的菌落数分别是210、50和520，取平均值260
D．四个平板，统计的菌落数分别是210、300、240和250，取平均值250
②一同学在稀释倍数为105的培养基中测得平板上菌落数的平均值为23.4，那么每毫升样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) 。
③用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量____，因为 。
④某同学在测定大肠杆菌的密度时发现，在培养基上还有其他杂菌的菌落，能否肯定该大肠杆菌的品系被污染了？为什么？
⑤分析下面培养基的配方：NaNO3、KH2PO4、NaH2PO4、MgSO4?7H2O、KCl、H2O。若此培养基用于培养分解尿素的细菌，则应除去上述成分中的 ，并加入葡萄糖、 物质。
⑥三位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中细菌数量。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下统计结果：
甲同学涂布了两个平板，统计的菌落数是236和260，取平均值248；
乙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是210、240和250，取平均值233；
丙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是21、212和256，取平均值163；
在三位同学的统计中，只有一位同学的统计是正确的，指出另两位同学的统计为什么不正确？
参考答案：
一、选择题1~6 DACCDC
二、非选择题
7.(2)①高压蒸汽(98kPa蒸汽)。②显微镜。③细菌大量繁殖，等量的生理盐水，低。④吞噬细胞、效应B细胞。
8.(1)牛肉膏、蛋白胨、水、无机盐、琼脂。蛋白胨、牛肉膏。(2)比例。搅拌，琼脂糊底引起烧杯破裂。(3)高压蒸汽灭菌锅，121℃，废弃。(4)适量水。(5)外，冷却，4℃。
9.(2)平板划线，稀释，每次划线前要灼烧接种环；冷却后从上一区划线末端开始划；首尾区不重叠。
(3)①D。②2.34×108。③多，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的是一个菌落。④不能；因为不能排除杂菌来自培养基或来自培养过程的可能。⑤NaNO3，尿素。⑥甲同学只涂布了两个平板，实验数据说服力不够；丙同学其中一个平板的计数结果与另两个相差太远，说明操作过程出现错误，数据缺乏正确性。